BADANIE SUROWCÓW I PRODUKTÓW PROBIOTYCZNYCH METODĄ CYTOMETRII PRZEPŁYWOWEJ
Wykorzystanie techniki cytometrii przepływowej w oznaczaniu liczby bakterii probiotycznych min. z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium jest alternatywną dla klasycznej metody hodowlanej. Celem metody jest szybkie zobrazowanie oraz dokładne rozróżnienie i zliczenie komórek żywych i martwych w kulturach bakterii. Metoda pozwala na obliczenie ilości komórek bakteryjnych w liofilizowanych kulturach bakterii na matrycach lipidowych lub glikoproteinowych, stosowanych do produkcji preparatów probiotycznych w różnych formach np. saszetki, kapsułki, zawiesiny olejowe. Metoda nie pozwala na rozróżnienie szczepów bakterii obecnych w próbce, jednak pozwala obliczyć całkowitą ilość żywych komórek baterii.
Zestaw do analizy cytometrycznej zawiera roztwór I zdolny do barwienia wszystkich komórek oraz roztwór II, który barwi tylko martwe komórki z uszkodzoną błoną komórkową. Roztwór I ma zdolność do wnikania we wszystkie komórki (martwe i żywe), jednak żywe komórki mają nieuszkodzoną błonę, przez którą Roztwór II nie jest w stanie przeniknąć. Dlatego połączenie tych dwóch roztworów pozwala na rozróżnienie żywych i martwych komórek.
Klasyczne metody płytkowe są technicznie proste, łatwe w wykonaniu i nie wymagają wykorzystania specjalistycznych urządzeń. Jednak konwencjonalne metody analityczne mogą wykryć tylko część bakterii żyjących w próbce. Ograniczają się one tylko do komórek zdolnych do tworzenia kolonii w warunkach wzrostu. Oznacza to, że wartości uzyskane metodą płytkową są fałszywie niskie, ponieważ tylko część mikroorganizmów obecnych w analizowanych próbkach może rosnąć na płytkach odżywczych używanych do ich oznaczenia. Komórki żywe, ale niehodowalne nie dają początku koloniom.
Nie ma jednej metodologii analitycznej, którą można by zastosować w przypadku wszystkich organizmów probiotycznych, ze względu na znaczne różnice w reakcji poszczególnych gatunków i szczepów na procedury posiewu i warunki niezbędne do uzyskania ich wzrostu na płytkach hodowlanych. Istnieje zaledwie kilka metod ISO dedykowanych analizie jakościowej probiotyków. Z drugiej strony rynek probiotyków charakteryzują liczne metody wewnętrzne opracowywane przez producentów probiotyków, które utrudniają obiektywne porównywanie ilości bakterii probiotycznych w produktach.
Zalety metody cytometrycznej :
– ma uniwersalne zastosowanie i może być wykorzystywana niezależnie od gatunku.
– jest metodą szybką: w ciągu 30 – 45 minut można uzyskać potrójną analizę;
– jest również niezależna od warunków wzrostu i nie wymaga użycia najlepszej pożywki
i parametrów namnażania jako wstępnego warunku,
– ma znacznie wyższą dokładność niż metody płytkowe,
– nie wymaga wzrostu komórek, dzięki czemu można oznaczyć tzw. „uśpione” komórki